10.3864/j.issn.0578-1752.2015.06.08
苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定及其对害虫的控制作用
【目的】分析并鉴定对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)具强致病性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CPB012菌株的杀虫基因型，为充分而有效地利用此生防菌奠定基础。【方法】CPB012菌株在LB培养基上30℃培养2—3 d，用苯酚品红进行晶体染色，观察伴孢晶体形态。cry1—cry10杀虫基因的检测选用技术成熟的PCR-RFLP（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism）法，即对某一类基因（如cry1、cry2…）保守区序列设计通用引物，并引入限制性内切酶识别序列，将扩增产物用相应的限制性内切酶处理，得到的酶切图谱可以初步判断杀虫基因多态性。同时结合特异性PCR方法对二、三级分类基因（如cry1A、cry2Aa…）设计特异性引物进行扩增，将扩增产物测序比对。cry11—cry40和vip基因通过设计引物进行PCR检测。菌株在LB培养基上培养24、48、72和96 h分别提取晶体蛋白，结合晶体蛋白的SDS-PAGE图谱分析其表达的杀虫蛋白。室内分别测定CPB012对鳞翅目家蚕(Bombyx mori)、鞘翅目马铃薯甲虫和双翅目橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)的杀虫效果；室内和田间测定CPB012与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）MJ07菌株对马铃薯甲虫的生物协同防治效果。【结果】通过菌株形态和晶体形态的连续观察，发现CPB012能够产生方形和球形等晶体。基因型检测表明CPB012菌株含有cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A，结合蛋白电泳图谱，其可能分别编码了约135、80、70、85—90 kD的大分子杀虫蛋白；同时可能还含有30和50 kD的两种新蛋白。室内生测试验显示，除马铃薯甲虫外，CPB012对家蚕和橘小实蝇也具有很强的毒杀作用，处理7 d 后死亡率分别为80.30%和76.72%。将CPB012与球孢白僵菌MJ07菌株按0.5﹕0.5剂量混合后室内接种，处理14 d后2龄马铃薯甲虫的累计死亡率达96.5%，极显著地(P<0.01)高于球孢白僵菌MJ07或苏云金芽孢杆菌CPB012单独处理的累计死亡率90.1%(MJ07)或83.3%（CPB012）。多重线性回归方程计算得出单独接种CPB012的LC50为1.88×107 cfu/mL,MJ07的LC50为5.46×107cfu/mL，而二者混用后LC50为1.10×107 cfu/mL，CTC（共毒系数）值为254，增效明显。在田间施用CPB012+MJ07混合剂(0.5﹕0.5)后对1龄和2龄马铃薯甲虫的防治效果分别为47.5%和43.8%,显著高于MJ07、CPB012和Bt药剂对照的防治效果。【结论】苏云金芽孢杆菌CPB012的杀虫功能由cry1Aa、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和vip3A等基因所决定，这些基因编码135、80、70、85-90 kD的杀虫毒蛋白。该菌的杀虫谱较广，对鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫都具有很强的生物毒性，其与球孢白僵菌MJ07混合施用可显著提高对马铃薯甲虫的防治效果。
苏云金芽孢杆菌CPB012、功能基因、杀虫晶体蛋白、马铃薯甲虫、球孢白僵菌MJ07、生物防治
S48;S33
国家公益性行业农业科研专项201103026
2015-04-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
1112-1121
