10.3864/j.issn.0578-1752.2015.04.06
烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssbx互作因子的鉴定
”目的”水稻条斑病菌(Xan thomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,Ssbx)通过病原菌Ⅲ”型分泌系统(type-Ⅲsecretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确Ssb,激发烟草产生HR的机理.”方法”将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-SfiAB载体上特殊酶切位点SfiI,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以Ssbt为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同深序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488nm处黄色激发光和520-550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-Ⅱ)观察Ssbx与烟草和水稻中互作因子的互作位点.”结果”水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-SfiAB载体上,平均片段大小1.0 kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-SfiAB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,Ssbr可与烟草和水稻的ADF2 (actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色,水稻OsADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9kD,而烟草NbADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.8 kD,两者同源性达69.02％.同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60％以上.双子叶植物烟草和拟南荞的ADF2同源性最高,相似性达69.05％;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81％.BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅Ssbx和OsADF2以及Ssbz和NbADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明Ssbx可与OsADF2或NbADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上.”结论”通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的Ssbx,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性.这为进一步揭示Ssbx如何激发植物产生HR的机制提供了依据.
水稻条斑病菌、单链DNA结合蛋白、肌动蛋白解聚因子、酵母双杂交、荧光双分子互补、过敏反应
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国家重点基础研究发展计划“973”计划2012CB114003、国家公益性行业农业科研专项201303015
2016-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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