10.3864/j.issn.0578-1752.2015.01.08
飞蝗表皮蛋白 Obstructor 家族基因的分子特性及基于 RNAi 的功能分析
【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白 Obstructor（Obst）家族基因的 cDNA 序列，并研究其序列特征和 mRNA 表达特性，探讨其生物学功能，为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得 Obst 家族基因 cDNA 片段，并进行 BLAST 分析得到 Obst 家族基因的 cDNA 序列；采用 RACE 技术扩增该家族基因的3′cDNA 序列，拼接后获得全长；SignalP 在线软件分析蛋白的信号肽，SMART 网站预测其功能域，并使用 Mega 5.10软件中 Neighbor-Joining 方法，与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster） Obst 家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）CPAP3家族基因（Obst 家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析；采用 real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测 LmObst 家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况，绘制表达图谱；采用 RNA 干扰（RNAi）技术探讨 LmObsts 对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst 家族基因的cDNA片段，通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇 Obst 高度同源，属于 LmObst 家族基因片段，其中5个是全长序列，3个序列缺失3′端；采用 RACE 技术获得3′末端 cDNA 序列；将得到的8个 LmObst 家族基因全长序列进行功能域分析，发现具有 Obst 家族表皮蛋白的特点，即有1个信号肽与3个几丁质结合域 ChtBD2；并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建，根据进化树分析结果，分别命名为 LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和 LmObst-E2。qPCR 结果显示 LmObst-E1和 LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达，LmObst-D1在体壁和前肠高表达，其他 LmObsts 在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达，在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达；LmObst 家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近，在5龄前期高表达，中期降到最低，蜕皮前又上升到高水平。采用 RNAi 技术研究基因的生物学功能，5龄若虫第5天分别注射 dsLmObst，对照组注射等量 dsGFP，48 h 后检测沉默效率，发现目的基因表达量显著降低；进一步观察发现，注射 dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象，在5龄若虫状态下死亡，剩余20%若虫蜕皮延迟1—2 d，并且蜕至成虫后，16 h 内全部死亡；其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1—3 d 的现象，但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗 LmObst家族基因，所有 Obst 家族蛋白功能域保守，均有1个信号肽与3个几丁质结合域 ChtBD2；LmObsts 主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的，该基因沉默可导致飞蝗死亡，其他7个 LmObsts 的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d，但无致死效应。
飞蝗、表皮蛋白、Obstructor、real-time quantitative PCR、RNAi
S852.65;S433.2;Q943.2
国家重点基础研究发展计划（973计划）;国家自然科学基金;高等学校博士学科点专项科研基金博导类
2015-02-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
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