精子介导的转基因效率关键影响因素

摘要：

[目的]精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同.但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大.现将主要探讨导致这种现象的原因.[方法]小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L-1的Cy-3标记DNA(Cy-3-DNA)在37℃共孵育30 min.其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率.精子与300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,以50μmol·L-1的P4诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例.精子分别与1 5和300 nmol·L-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置.按照优化后的条件,精子分别与0、1 5和300 nmol·L-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎.比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况.[结果]获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21％、73.63％、77.38％、76.33％和77.80％;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76％、94％、99％和100％,15、30和300 nmol·L-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L-1组(P＜ 0.05).洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45％、66％、84％和87％,消化后精子内化DNA的效率分别为44％、56％、71％和76％,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L‘组和30 nmol·L-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L-1组显著高于3 nmol·L-1组(P＜0.05);Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加(P＜0.01).顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,但精子头部后区的外源DNA依然会保留,因此,顶体反应前后,精子结合外源DNA的精子比率没有降低.1 5和300 nmol·L-1 DNA共孵育的精子体外受精后,荧光显微镜下检测显示,合子期胚胎有外源DNA的荧光信号分布,将荧光信号在雄原核附近密集的胚胎记为阳性胚胎,300 nmol·L-1 DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89％,显著高于1 5nmol·L-1组的9.00％(P＜0.05).精子与pEGFP-C1质粒共孵育后,体外受精,结果表明精子与DNA共孵育后,卵母细胞受精率及胚胎卵发育率与对照组相比差异不显著.单囊胚PCR检测1 5和300 nmol·L-1的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率分别为8.72％和21.50％;采用RT-PCR方法在300 nmol·L-1组的囊胚中检测到了EGFP基因RNA的表达,在荧光显微镜下没有观察到EGFP绿色荧光蛋白的表达.[结论]精子具备结合和内化外源DNA的能力,并能将外源DNA带入卵母细胞,顶体反应会使精子丢失顶体部DNA,但精子头部后区外源DNA依然保留.受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导转基因效率的关键影响因素.

关键词：精子介导转基因、DNA浓度、顶体反应、外源基因整合与表达、小鼠

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分类号：R711.6;R321.1;S828.36

资助基金：国家自然科学基金31101033

在线出版日期：2015-01-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：4086-4095