猪β2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建

摘要：

【目的】利用重组β2肾上腺素能受体（β2AR）检测β2激动剂类药物，是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β2AR并构建其重组穿梭表达质粒，为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β2AR并进行序列分析，完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织，提取总RNA，根据GenBank已登录的猪β2AR核苷酸序列（AF000134），设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化 DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作 PCR 鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力，对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造；为使表达蛋白C端携带6×His标签，对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体，连接产物转入NovaBlue感受态细胞，经Amp抗性筛选，挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析，所提猪肝细胞总 RNA 的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示，在1200 bp 左右出现1条特异性条带，与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β2AR经鉴定，证实为阳性重组质粒。测序结果显示，所得猪β2AR基因cDNA序列全长1257 bp，编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank，登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β2AR（AF000134）相比，基因序列一致性为99.68%，4处发生碱基突变，编码的氨基酸序列一致性为99.28%，3处发生突变，且配体与受体结合位点处的氨基酸均得到正确克隆。在线 BLAST分析表明，猪与其它物种的β2AR及氨基酸序列一致性均在80%以上，具有较高的同源性。由系统进化树分析可知，所克隆的猪β2AR与领西猯Pecan tajacu（JN 633666.1）的亲缘性较近，与大仓鼠Tscherskiatriton（AY683091.1）和草原田鼠Microtusochrogaster （XM 005356183.1）的亲缘性较远。氨基酸疏水性分析表明，该受体蛋白 N 端以疏水性氨基酸为主，C 端以亲水性氨基酸为主。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析证明，成功构建重组穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β2AR1-418和 pTriEx-1.1Hygro-β2AR63-418。【结论】所获克隆基因与已发表猪β2AR高度一致，且活性位点处的氨基酸均得到正确克隆。此外，pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体适宜用作大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统的启动子，是研究目标基因在不同表达系统表达效果的良好材料。本文所构建的穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β2AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β2AR63-418均可用于以上3种表达系统中β2AR蛋白的表达纯化研究。

关键词：猪、β2肾上腺素能受体、基因克隆、序列分析、穿梭表达质粒

分类号：S851.2;Q78;R739.41

资助基金：公益性行业农业科研专项201203094

在线出版日期：2014-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：3691-3699