豆状带绦虫TPO18基因的原核表达及保护性分析

摘要：

明确重组蛋白 pGEX-TPO18的免疫保护效果。提取豆状带绦虫六钩蚴 RNA，根据带科其他种属绦虫18 kD 基因的保守区设计引物，5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点，RT-PCR 扩增，产物克隆于 pMD18-T中进行序列测定，并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的 PCR 产物和质粒 pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ＋XhoⅠ双酶切，回收目的片段，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞，挑斑摇菌，通过 PCR 方法和重组质粒测序技术进行鉴定，将鉴定正确的重组表达质粒命名为 pGEX-TPO18。用 IPTG 诱导表达重组质粒，收集菌体进行 SDS-PAGE 分析，用 GST 琼脂糖树脂纯化 TPO18蛋白，进行 Western blottting 检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔，每次50μg/只，共免疫3次，末次免疫后34 d 每只家兔感染1500个虫卵，感染58 d 后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔7 d 采血分离血清， ELISA 法检测血清抗体水平，以40μg·mL-1重组蛋白包被酶标板，血清1﹕200稀释，检测血清样品的 OD492nm 值。TPO18基因的 RT-PCR 扩增产物为339 bp,与预期大小相符；测序结果表明无碱基突变，重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物为38.6 kD 的可溶性蛋白，Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带，表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测，免疫后7 d 免疫组家兔抗体水平开始升高，第43天达到峰值。经口感染虫卵后，免疫组抗体水平开始降低，但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为79.13%、65.66%和50.43%。研究表明弗氏佐剂免疫效果较好，有望研制出抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗。

关键词：豆状带绦虫、TPO18、原核表达、免疫保护性分析

分类号：R38;R57

资助基金：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目GNSW-2010-01;甘肃省科技支撑计划项目1104NKCA082

在线出版日期：2014-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：3077-3084