绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

摘要：

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP），获得原核表达的重组蛋白，为ALUSP的功能研究奠定基础，也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物，获得ALUSP的保守序列；再通过设计特异性引物，利用RACE方法，分别克隆ALUSP 5′及3′段序列，然后通过拼接获得ALUSP全长序列；应用生物信息学方法，对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析，建立系统进化树；将含有ALUSP的T载体经EcoR I及XhoI双酶切，构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP，将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达，再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1005 bp，编码334个氨基酸，预测分子量56.63 kD，理论等电点8.42；序列特征分析表明，该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征，由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成，其中C域高度保守，包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒，且含有由8个氨基酸构成的核定位信号，D域含有1个识别DNA元件的T-盒，E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构；氨基酸比对结果表明，ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%），与其他昆虫的USP序列一致性较低，如膜翅目的Meliponascutellaris（46.05%）、Scaptotrigonadepilis（45.94%）；系统进化树分析结果显示，半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化，位于不同分支，ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近，可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上，命名为pEGX6P1-ALUSP；经37℃、1.0 mmol·L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白，并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在；收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析，最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带，表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长，其具有昆虫超气门蛋白的典型特征，并获得了原核表达的重组蛋白。

关键词：绿盲蝽、超气门蛋白、基因克隆、原核表达

分类号：S43;S88

资助基金：国家公益性行业农业科研专项201103012;国家自然科学基金项目31301668，31301669;国家现代农业产业技术体系建设专项CARS-18-16

在线出版日期：2014-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：2162-2172