棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin及其启动子的克隆和功能分析

摘要：

【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子，明确其表达特征，分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆（78L16）的测序结果，首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列，并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS 连接的重组载体pGbNocotin：GUS，并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株，分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框（ORF）序列，并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树分析，最后利用实时荧光定量PCR（Real Time PCR）对该基因进行组织表达，诱导表达分析。【结果】GbNocotin的启动子区为1.8 kb，通过相似性比较预测发现该启动子含有1个专一性 Fe 缺乏诱导元件 IRO2OS，还含有干旱、重金属、病原物等逆境响应元件以及植物激素响应元件等。对转化pGbNocotin：GUS拟南芥植株的GUS染色结果表明，在幼苗期GUS基因主要在根部以及下胚轴处表达，而在成熟期除了在根部表达外，还在果荚的基部、花序以及叶柄基部表达。GbNocotin的开放阅读框含有864个核苷酸，编码287个氨基酸，该蛋白等电点为6.76，分子量为32.7 kD。虽然在第11-286位氨基酸处具有NAS保守结构域（PFAM accession number： PF03059），但是与其他植物来源的该类基因相似性较低，与相似度最高的拟南芥的ATNAS3也仅有43%的相似性。GbNocotin的表达具有器官差异性，在根和茎中的表达最强，其次是棉纤维和花，但是在叶片及胚珠中表达量很低。另外，该基因在缺铁条件下表达量显著上升，在缺铁处理一周后棉花幼根中的表达量较对照增加9倍。而CuSO4、PEG、脱落酸（ABA）以及赤霉素（GA）处理均抑制其表达，但是抑制程度不同。尽管4种条件处理24 h后都会使GbNocotin的表达量显著降低，但是CuSO4和ABA的抑制效果最为显著。而48 h后， PEG和GA处理基因的表达量得到恢复，但是CuSO4和ABA处理表达量仍然较低。【结论】GbNocotin的表达具有器官差异性，并受铁缺失诱导以及胁迫条件抑制。该基因与棉花Fe的吸收可能密切相关，有潜在的应用价值。

关键词：棉花、烟酰胺合成酶基因、启动子、器官差异、缺铁诱导

分类号：S562;Q786;S601

资助基金：江苏省自然科学基金CX132029;BK20131336

在线出版日期：2014-05-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1041-1050