牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

摘要：

[目的]筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA，构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒，为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。[方法]以秦川牛SREBP1基因为研究对象，首先靶向其编码区（coding sequence，CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA，并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞，筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组，得到腺病毒重组载体，并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒，GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞，实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。[结果]筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒，测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU·mL-1和9×108 GFU·mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞，qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%），而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。[结论]成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA，并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。

关键词：牛、SREBP1、shRNA、重组腺病毒

分类号：R542.22;S828.2;Q78

资助基金：国家自然科学基金;国家高技术研究发展计划（863计划）;长江学者和创新团队发展计划;国家科技支撑计划;转基因生物新品种培育科技重大专项;国家肉牛牦牛产业技术体系项目

在线出版日期：2013-12-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：5026-5036