副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

摘要：

[目的]利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membraneprotein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法.[方法]克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物.将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化,最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.[结果]利用克隆表达的HPS OMP5蛋白做抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1:400,血清的最佳稀释度为1:160.用建立的间接ELISA方法检测317份未进行HPS免疫的健康猪血清,结果检出72份阳性,检出率为22.71%,与广东地区发病猪中的HPS分离率24%接近.同时,用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA方法同时检测了78份血清样品,结果,该法检出27份阳性,检出率为34.62%,后者则检出31份阳性,检出率为39.74%,二者符合率为71.79%.[结论]本研究利用重组表达的OMP5蛋白作为抗尿建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性好、重复性好,检出率与HPS临床分离率接近,可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控.

关键词：副猪嗜血杆菌、外膜蛋白P5、克隆、表达、间接ELISA

所属期刊栏目：44

分类号：S855.12(动物医学（兽医学）)

资助基金：广东省农业科技重大专项;广州市农业科技重大专项

在线出版日期：2012-01-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：3036-3044