远隔缺血预适应血清外泌体对神经细胞DNA甲基化水平及缺血耐受相关基因表达的影响

摘要：

目的 研究人远隔缺血预适应(RIPC)后产生的血清外泌体对人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y神经细胞)DNA甲基化及氧糖剥夺(OGD)耐受的影响.方法 6名男性在校大学生志愿者(身高:170～180 cm;体质量:60～80 kg;状态:上午、空腹)使用RIPC训练仪进行缺血预适应并采集肘中静脉血和血清,使用透射电镜方法对外泌体形态进行检测和鉴定.构建神经细胞OGD模型,当正常细胞培养至70％细胞密度时,撤去1640培养基改用无糖培养基,将OGD处理的SH-SY5Y细胞与外泌体孵育后进行处理,分为正常对照组(C组)、氧糖剥夺组(OGD组)、OGD+HuE-C组(SH-SY5 Y细胞经过OGD处理后与正常人血清外泌体共孵育)、OGD+HuE-RIPC组(SH-SY5 Y细胞经过OGD处理后和RIPC人血清外泌体共孵育).3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基喹啉)-2-(4-磺基苯基)-2 H-四唑(MTS)法检测细胞对OGD的耐受,亚硫酸氢钠限制性内切酶试验(COBRA)分析神经细胞基因组甲基化程度,实时聚合酶链反应(PCR)和Western Blot分析血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)的基因及蛋白表达水平.结果 透射电镜结果显示,超速离心法可以成功分离血清外泌体.显微镜下观察正常SH-SY5Y细胞胞体丰满,经历OGD后,大量细胞呈皱缩高亮的凋亡状态;加入HuE-C外泌体后细胞形态恢复有限;加入HuE-RIPC外泌体后,SH-SY5Y细胞形态有了较为明显的恢复.形态学分析结果显示,RIPC外泌体对缺血状态下神经细胞有保护作用.MTS结果显示,在OGD模型中,将人RIPC血清外泌体与SH-SY5Y细胞共孵育后,SH-SY5Y细胞活力较OGD组明显提高(P<0.01).COBRA实验结果显示,在SH-SY5Y细胞OGD模型中加入人RIPC血清外泌体后,SH-SY5Y细胞Alu甲基化程度下降(P=0.048),LINE-1非甲基化水平升高(P=0.040),LINE-1甲基化水平下降(P=0.004),细胞基因组甲基化呈显著下调趋势.实时PCR和Western Blot检测结果显示,加入RIPC血清外泌体后,OGD模型中,SH-SY5Y细胞中EPO、VEGF mRNA的基因表达水平明显上调(P=0.001、0.004)和EPO、VEGF蛋白表达水平明显升高(均P=0.008).结论 RIPC血清外泌体可对OGD下的神经细胞产生保护作用,可能是通过降低SH-SY5Y神经细胞基因组甲基化程度并上调VEGF、EPO等缺血耐受相关基因的表达,促进神经细胞缺血耐受.

关键词：远隔缺血预适应、外泌体、缺血耐受、神经保护

所属期刊栏目：18

资助基金：国家自然科学基金资助项目;内蒙古自治区高等学校科学研究项目

在线出版日期：2021-03-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：107-114