神经元表达发育下调基因siRNA表达载体的构建及鉴定

摘要：

目的:构建针对神经元表达发育下调基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对A549肺腺癌细胞株中NEDD9表达的抑制作用.方法:根据GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)核苷酸序列及siRNA的设计原则,筛选得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列;分别合成4对带有BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入载体pRNAT-CMV3.2中构建重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.用脂质体介导转染入A549肺腺癌细胞株,采用QRT-PCR和Western blot方法检测细胞NEDD9基因mRNA和蛋白表达.结果:PCR筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低A549细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达.结论:成功构建载体介导的NEDD9靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制A549细胞中NEDD9基因的表达.

关键词：肺腺癌、神经元表达发育下调基因9、RNA干扰、A549

所属期刊栏目：30

分类号：R734.2(肿瘤学)

资助基金：2012年河南省教育厅基础项目基金122300410363

在线出版日期：2014-06-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：499-504