稳定过表达生长分化因子5基因大鼠脂肪干细胞系的建立

摘要：

目的:探讨慢病毒介导的稳定过表达生长分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干细胞(ASCs)的构建条件和方法.方法:取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁法分离培养大鼠ASCs.倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型.制备带GDF-5/GFP融合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的转染效率,选择最佳MOI,采用流式细胞仪检测转染效率.对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率.筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率;并采用CCK-8法检测转染后细胞活力.结果:成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定:间充质干细胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表达阳性,造血细胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干细胞表面抗原(CD106)表达阴性.成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs最佳MOI为40,转染率为65%.采用GFP荧光流式细胞筛选技术筛选后阳性率可提高至96%.CCK-8法显示,转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异.结论:胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs,流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,且对细胞系活力无显著影响,转染细胞传代5代仍可稳定过表达.

关键词：脂肪干细胞、慢病毒、生长分化因子5、流式细胞仪、转染

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分类号：R-33(医学研究方法)

资助基金：国家自然科学基金31170925;国家重点基础研究发展计划子课题2009CB930002.Supported by National Natural Science Foundation of China31170925;National Basic Research Program of China973 Program,2009CB930002

在线出版日期：2017-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：181-187