pFLAG-AMPKα2真核表达质粒构建及对心肌缺氧/复氧损伤的作用

摘要：

目的:构建大鼠pFLAG-AMPKα2真核表达质粒,分析AMPKα2过表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响.方法:提取H9c2心肌样细胞的mRNA,反转录为 cDNA.PCR扩增AMPKα2基因的cDNA全长,并将其克隆至pFLAG-CMV-4构建pFLAG-AMPKα2重组质粒.转染pFLAG-AMPKα2至H9c2细胞,Western Blot测定AMPKα2的蛋白表达情况,建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,MTT法检测心肌细胞的存活率,生物自动分析仪检测LDH活性,流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡程度、细胞内ROS的变化,试剂盒检测细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性.结果:AMPKα2全长基因序列克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4,酶切鉴定片段大小为1700 bp,Western blot检测转染pFLAG-AMPKα2后,AMPKα2蛋白在H9c2细胞中高表达.H9c2细胞遭受A/R损伤,心肌细胞存活率下降,LDH活性增加,细胞凋亡加重,ROS生成增加,SOD及GSH-Px的酶活性下降,pFLAG-AMPKα2重组质粒的导入可明显逆转、改善上述各项指标,从而对抗A/R损伤.结论:构建成功的pFlAG-AMPKα2重组质粒能对抗A/R所致的心肌细胞损伤,其机制与改善心肌细胞的氧化应激作用有关.

关键词：AMPKα2、缺氧/复氧损伤、凋亡、ROS、氧化应激

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分类号：R965.2(药理学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81160402,81072632,81100104;博士后科学基金资助20110491496;江西省自然科学基金资助项目2010GQY0230

在线出版日期：2013-03-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1333-1338