人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及生物学活性鉴定

摘要：

目的:探索人髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)的提纯方法并鉴定其生物学活性.方法:收集3例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织(Pfirrmann分级均为Ⅳ级),利用酶消化法分离细胞.采用两种方法分离提纯NPMSCs,一组细胞采用贴壁法培养(贴壁组),另一组通过流式细胞分选技术利用NPMSCs表面阳性标志物CD73、CD90、CD105获得NPMSCs(流式组).将两种方法获得的NPMSCs进行体外培养扩增,分别进行形态学观察,细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit,CCK-8)检测增殖能力.贴壁组NPMSCs采用流式细胞分选仪在进行分选之前检测免疫表型,流式组NPMSCs在生长达80％～90％融合时进行免疫表型的检测.向成骨、成脂、成软骨诱导分化,诱导28d后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红O染色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力,利用Imag J软件计算染色区域所占的面积百分比.比较两组NPMSCs在形态学、免疫表型及增殖和分化能力的差异.结果:形态学观察发现,两组NPMSCs均呈漩涡状生长,贴壁组NPMSCs可见散在的单个细胞生长;流式组NPMSCs长梭形形态更长,排列更加紧密,少见散在的单个贴壁生长细胞.流式细胞分选后所得的NPMSCs占细胞总数的(89.67±2.52)％,可以进行体外培养扩增,细胞为典型的长梭形特征,漩涡状生长,在接种后12～15d达80％～90％融合,增殖能力在接种后5～13d明显高于贴壁组NPMSCs (P＜0.05).流式组NPMSCs的CD73、CD90、CD105的表达率明显高于贴壁组NPMSCs(P＜0.05),并且低表达CD34、CD45及HLA-DR.两种方法获得的NPMSCs均能完成三系诱导分化,流式组成骨、成脂、成软骨染色区域百分比均明显高于贴壁组(P＜0.05).结论:利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中可获得较高纯度的NPMSCs,并能进行后续培养扩增.与贴壁法获得的NPMSCs相比,流式细胞分选的NPMSCs具有更强的增殖与分化能力.

关键词：髓核间充质干细胞、流式细胞分选、分离提纯、生物学活性

所属期刊栏目：25

分类号：Q813.1(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家自然科学基金面上项目81171740、81470102

在线出版日期：2015-08-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：533-540