长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8基因的鉴定及其抵抗田鼠巴贝虫感染作用的研究

摘要：

目的 对长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8(cas8)基因进行鉴定,探究其在长角血蜱抵抗田鼠巴贝虫感染中的作用,为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的研究奠定基础.方法 提取长角血蜱RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增cas8,测序后在GenBank中进行BLAST比对.用MEGA软件,采取邻接法构建基于cas基因的系统进化树.以叮咬田鼠巴贝虫感染小鼠的长角血蜱若蜱为感染组,以叮咬正常小鼠的同批次若蜱为对照组.感染组与对照组各取9只蜱,提取RNA并逆转录为cDNA,采用定量PCR(qPCR)分析感染组与对照组长角血蜱cas8基因相对转录水平差异;提取感染组和对照组长角血蜱若蜱总蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测CAS8的相对表达量.合成cas8基因和荧光素酶基因的双链RNA(dsRNA),分别显微注射至长角血蜱若蜱体内进行RNA干扰(RNAi)(RNAi组和对照组),12～24 h后取活性良好的蜱叮咬田鼠巴贝虫感染小鼠,饱血后立即收集蜱,qPCR检测cas8基因的相对转录水平,实时PCR(探针法)检测长角血蜱体内田鼠巴贝虫的18S rRNA基因.感染组和对照组cas8基因相对转录水平和蛋白相对表达水平、RNA干扰组和干扰对照组田鼠巴贝虫18S rRNA基因含量的比较采用t检验.结果 长角血蜱cas8基因长1 377 bp,序列提交GenBank获得的登录号为PP407944,其预测的氨基酸序列与 GenBank 中的长角血蜱 CAS8(GenBank:ABG48761.1)、镰形扇头蜱CAS8(GenBank:ALQ43547.1)的氨基酸序列一致性分别为21.26％和61.24％.系统进化树分析结果显示,cas8基因与GenBank中的长角血蜱cas基因(ABG48665.1、ABG48761.1)均不在同一分支上,且亲缘关系较远;与镰形扇头蜱cas8基因(GenBank:ALQ43547.1)的亲缘关系较近,在同一分支上.qPCR分析结果显示,感染组cas8基因的相对转录水平为0.562±0.036,高于对照组的0.198±0.071(t=7.910,P＜0.01).Western blotting结果显示,感染组CAS8蛋白的相对表达水平为0.460±0.013,高于对照组的0.346±0.007(t=9.368,P＜0.01).沉默cas8后,RNAi组cas8基因的相对转录水平为0.036±0.003,低于对照组的0.081±0.006(t=10.680,P＜0.01);RNAi组田鼠巴贝虫18S rRNA基因为3.35 × 106拷贝/μl,高于对照组的1.35 × 106拷贝/μl(t=4.570,P＜0.05).结论 CAS8是长角血蜱凋亡相关分子,能够抵御田鼠巴贝虫感染长角血蜱,可以作为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的候选靶向分子.

关键词：长角血蜱、人兽共患病、田鼠巴贝虫、天冬氨酸蛋白水解酶8、RNA干扰

所属期刊栏目：42

分类号：R384.41(医学寄生虫学)

在线出版日期：2024-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：433-438