携带Fluc和ZsGreen双报告基因小鼠iPS细胞系的建立

摘要：

背景与目的:诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)在修复受损组织器官和治疗人类疾病方面已展示了良好的应用前景,但iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用,这是其安全应用于临床的巨大障碍之一.为此本研究拟利用慢病毒体外感染的方法,建立携带萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,ZsGreen)双报告基因的小鼠iPS细胞系,为活体动态监测畸胎瘤形成、定植和形成畸胎瘤所需最小细胞剂量等提供实验基础.方法:构建含Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体.以pLH2BmRFP质粒为模板,PCR扩增获得Fluc基因片段,将其克隆至利用BamHⅠ酶切的pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen质粒中,挑选一个阳性克隆质粒进行测序,最终获得携带双报告基因的慢病毒载体pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen(pELZG).采用脂质体介导的瞬时转染生产携带Fluc和ZsGreen基因的病毒,收集病毒上清,并感染iPS细胞,数天后荧光显微镜下观察是否有绿色荧光的iPS细胞克隆,不断挑取ZsGreen阳性的iPS细胞克隆以进一步纯化.将标记好的iPS细胞移植入裸鼠皮下,观察成瘤情况.结果:pELZG载体分别经XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ单酶切,得到的片段大小分别为10.005、3.282和6.723 kb,2.441、3.401和6.604 kb,预示成功构建了Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体.利用其生产的病毒上清成功感染iPS细胞,经过不断的纯化,最终获得含稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系.将标记好的iPS细胞植入裸鼠皮下后,观察到畸胎瘤的形成.结论:成功建立了携带Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系,为相关后续研究打下了良好的基础.标记后的iPS细胞对畸胎瘤的形成和发展具有很好的示踪作用.

关键词：萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白、慢病毒、293T细胞、诱导性多潜能干细胞、畸胎瘤

分类号：R730.269(肿瘤学)

在线出版日期：2013-03-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：10-16