利用CRISPR/Cas9在人类黑色素瘤细胞中编辑MC1R与功能分析

摘要：

MC1R(melanocortin 1 receptor)基因编码黑皮质素1型受体,它在配体α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)的刺激下,可促进细胞内cAMP(cyclic adenosine monophosaphate)的生成,从而激活PKA(protein kinase A system)信号通路,促进黑色素合成调控的关键转录因子–小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF),以及限速酶–酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)的表达,进而调控真黑素和褐黑素的合成,影响动物的毛色表型.有研究表明,杜洛克猪(Susscrofa domestica)MC1R蛋白第6个跨膜结构域(transmembrane domain 6,TM6)发生了A243T突变,该突变可能影响MC1R蛋白生物学功能,被认为是导致杜洛克猪红毛表型的主要因素,然而却一直未被验证过.因此,本研究以单链寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides,ssODN)作为同源重组模板,利用CRISPR/Cas9技术在人类黑色素瘤细胞系SK-MEL-2中引入MC1R基因的c.727G>A(A243T)突变,以分析其对MC1R功能的影响.结果表明ssODN发生同源重组的效率可达10％.通过对共转染ssODN和CRISPR/Cas9表达载体的细胞进行筛选和培养,获得6个单克隆细胞株,进行测序鉴定,结果未能筛选到发生预期突变的单克隆细胞株,所有单克隆细胞株皆在目标位点周围出现突变.对转染后的细胞群进行功能分析,结果发现其cAMP信号强度、MITF基因和TYR基因表达量均显著低于未转染的细胞,表明编辑MC1R可影响细胞的黑色素合成功能.本研究为深入分析MC1R突变影响动物毛色提供了进一步的参考.

关键词：MC1R、基因定点突变、CRISPR/Cas9、A243T

所属期刊栏目：44

分类号：R730.45;S828;R329.2

资助基金：广东省重点领域研发计划项目;广东省自然科学基金

在线出版日期：2022-07-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：581-590