10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.04.013
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合雷公藤甲素诱导胰腺癌细胞凋亡的机制研究
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合雷公藤甲素(Triptolide)诱导胰腺癌细胞凋亡的机制.方法 (1)将人胰腺癌细胞MiaPaca-2(简称MiaPaca-2细胞)分为4组:空白对照组(不加任何药物),TRAIL+ Triptolide-组(仅加TRAIL),TRAIL-Triptolide+组(仅加Triptolide)和TRAIL+Triptolide+组(加TRAIL和Triptolide).采用CCK-8检测各组细胞活力.采用Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(Caspase-8)的表达.加入Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK后,采用CCK-8检测细胞活力,采用Caspase-Glo荧光检测法检测Caspase-8活性.采用Western blot检测各组细胞髓样细胞白血病-1(Mcl-1)、额外的大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的表达.(2)将MiaPaca-2细胞分为8组:①TRAIL-Mcl-1 siRNA-组(不加TRAIL、不转染Mcl-1 siRNA),TRAIL+ Mcl-1siRNA-组(加TRAIL、不转染Mcl-1 siRNA),TRAIL-Mcl-1 siRNA+组(不加TRAIL、转染Mcl-1 siRNA)和TRAIL+ Mcl-1 siRNA+组(加TRAIL、转染Mcl-1 siRNA).②TRAIL-Bcl-xL siRNA-组(不加TRAIL、不转染Bcl-xL siRNA),TRAIL+ Bcl-xL siRNA-组(加TRAIL、不转染Bcl-xL siRNA),TRAIL-Bcl-xL siRNA+组(不加TRAIL、转染Bcl-xL siRNA),TRAIL+ Bcl-xL siRNA+组(加TRAIL、转染Bcl-xL siRNA).采用CCK-8检测各组细胞活力.采用Western blot检测各组细胞Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达.符合正态分布的计量资料以(x)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 (1)空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组、TRAIL-Triptolide+组和TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞活力分别为100.0％±1.1％、81.2％±2.3％、78.6％±3.6％、40.1％±2.5％;PARP蛋白相对表达量分别为0.510 ±0.028、0.720±0.072、1.250±0.023、2.560±0.220;Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.080±0.004、0.080±0.003、0.110±0.005、2.720 ±0.003;Caspase-8蛋白相对表达量分别为0.070±0.003、0.080±0.005、0.120 ±0.003、0.990±0.006,4组比较,差异均有统计学意义(F=203.607,1 457.785,332 421.900,35 437.218,P＜0.05).TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞活力与空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组和TRAIL-Triptolide+组分别比较,差异均有统计学意义(t=34.583,355.936,36.271,P＜0.05);TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞中PARP蛋白相对表达量与空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组和TRAIL-Triptolide+组分别比较,差异均有统计学意义(t =591.784,63.739,2 268.987,P＜0.05);TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Caspase-3蛋白相对表达量与空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组和TRAIL-Triptolide+组分别比较,差异均有统计学意义(t=3 266.153,9 145.228,1 738.713,P＜0.05);TRAIL+Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Caspase-8蛋白相对表达量与空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组和TRAIL-Triptolide+组分别比较,差异均有统计学意义(=663.953,1 432.878,327.584,P＜0.05).TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞加Z-IETD-FMK前,Caspase-8活性为711.0％±5.1％;加入Z-IETD-FMK后,细胞活力为70.0％±4.8％,Caspase-8活性为73.0％±2.4％;加Z-IETD-FMK后细胞活力升高,Caspase-8活性降低,两者比较,差异均有统计学意义(t=17.956,55.027,P＜0.05).空白对照组、TRAIL+ Triptolide-组、TRAIL-Triptolide+组和TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Mcl-1蛋白相对表达量分别为1.68±0.22、2.08±0.11、0.73±0.15、0.58±0.18,Bcl-xL蛋白相对表达量分别为0.65±0.03、0.47±0.03、0.32±0.03、0.26±0.05,Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.65 ±0.03、0.67±0.03、0.62 ±0.05、0.67±0.03,4组比较,差异均有统计学意义(F =55.178,88.683,3.411,P＜0.05).TRAIL-Triptolide+组和TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Mcl-1蛋白相对表达量与空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(=23.506,47.631,P ＜0.05);上述两组与TRAIL+ Triptolide-组分别比较,差异均有统计学意义(t=58.457,37.115,P＜0.05).TRAIL-Triptolide+组和TRAIL+Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Bcl-xL蛋白相对表达量与空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(t=38.105,42.219,P ＜0.05);上述两组与TRAIL+ Triptolide-组分别比较,差异均有统计学意义(t=32.476,15.814,P ＜0.05).TRAIL-Triptolide+组和TRAIL+ Triptolide+组MiaPaca-2细胞中Bcl-2蛋白相对表达量与空白对照组分别比较,差异均无统计学意义(t=4.724,1.732,P＞ 0.05);上述两组与TRAIL+ Triptolide-组分别比较,差异均无统计学意义(t=3.464,0.000,P＞0.05).(2)TRAIL-Mcl-1 siRNA-组、TRAIL+ Mcl-1siRNA-组、TRAIL-Mcl-1 siRNA+组和TRAIL+ Mcl-1 siRNA+组MiaPaca-2细胞活力分别为100.0％ ±2.2％ 、79.3％±1.8％ 、71.2％±3.2％ 、37.3％±5.4％,Caspase-8蛋白相对表达量分别为0.100 ±0.003、0.100 ±0.005 、0.100±0.003、0.350±0.005,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.020±0.003、0.060±0.003 、0.020 ±0.003、0.590 ±0.004,4组比较,差异均有统计学意义(F=136.681,2 717.391,44471.429,P＜ 0.05).TRAIL+ Mcl-1 siRNA+组MiaPaca-2细胞活力与TRAIL-Mcl-1 siRNA-组、TRAIL+ Mcl-1 siRNA-组和TRAIL-Mcl-1 siRNA+组分别比较,差异均有统计学意义(t=33.937,20.207,26.689,P＜ 0.05);TRAIL+ Mcl-1 siRNA+组MiaPaca-2细胞Caspase-8蛋白相对表达量与TRAIL-Mcl-1 siRNA-组、TRAIL+Mcl-1 siRNA-组和TRAIL-Mcl-1 siRNA+组分别比较,差异均有统计学意义(=216.506,433.013,144.338,P＜ 0.05);TRAIL+ Mcl-1 siRNA+组MiaPaca-2细胞Caspase-3蛋白相对表达量与TRAIL-Mcl-1 siRNA-组、TRAIL+ Mcl-1 siRNA-组和TRAIL-Mcl-1 siRNA+组分别比较,差异均有统计学意义(t=329.090,458.993,987.269,P＜ 0.05).TRAIL-Bcl-xL siRNA-组、TRAIL+ Bcl-xL siRNA-组、TRAIL-Bcl-xL siRNA+组和TRAIL+ Bcl-xL siRNA+组MiaPaca-2细胞活力分别为100.0％±2.3％、87.2％±4.1％、74.1％±3.7％、56.3±5.4％,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.060±0.004、0.070±0.003、0.060±0.004、0.390±0.003,4组比较,差异均有统计学意义(F=70.074,4 643.478,P＜0.05).TRAIL+ Bcl-xL siRNA+组MiaPaca-2细胞活力与TRAIL Bcl-xL siRNA-组、TRAIL+ Bcl-xL siRNA-组和TRAIL-Bcl-xL siRNA+组分别比较,差异均有统计学意义(=24.416,41.170,18.136,P ＜0.05);TRAIL+ Bcl-xL siRNA+组MiaPaca-2细胞Caspase-3蛋白相对表达量与TRAIL-Mcl-1 siRNA-组、TRAIL+ Mcl-1 siRNA-组和TRAIL-Mcl-1 siRNA+组分别比较,差异均有统计学意义(t=285.788,554.256,190.526,P＜0.05).结论 Triptolide可能通过抑制Mcl-1与Bcl-xL表达水平,致敏TRAIL,激活Caspase-8及其下游的Caspase-3,最终诱导胰腺癌细胞凋亡.
胰腺肿瘤、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、雷公藤甲素
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R735.2;R285.5;R329.25
国家自然科学基金81472775
2015-05-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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321-328
