RNA干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白表达的研究

摘要：

目的 本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学合成双链RNA(dsRNA)诱导RNA干扰(RNAi)的效应强度及其作用特点,为采用RNAi技术开展基因治疗提供实验依据.方法 ①采用磷酸钙沉淀法构建293T/GFP细胞株.②体外化学合成dsRNA,经由三种不同的阳离子脂质体TransIT-TKO,Oligofectamine reagent,Lipofectamine 2 000导入293T/GFP细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪测定荧光强度的变化,观察不同阳离子脂质体的体外转染效率.③采用dsRNA-Lipofectamine 2000复合物转染293T/GFP细胞.dsRNA分设5个不同的浓度(0.01,0.02,0.04,0.08,0.16 μmol/L)转染细胞48 h以观察剂量效应关系.dsRNA 0.08μmol/L/ Lipofectamine 2000 8μl 转染细胞,于4个不同的时间点(12 h,24 h,48 h,72h)观察时间效应关系.结果 绿色荧光蛋白序列特异性dsRNA(dsRNA-Egfp)经由三种不同的阳离子脂质体导入细胞均可产生RNAi效应,序列非特异性dsRNA(dsRNA-unrelated)无抑制效应.在三种不同的阳离子脂质体中,Lipofectamine 2000的转染效率最强,转染48 h可将293T/GFP细胞荧光强度降低约80%,与空白载体组比较差异显著,TransIT-TKO组,Oligofectamine reagent组分别降低41.02%、37.45%,与空白载体组比较无显著性差异,而且TransIT-TKO、Oligofectamine的细胞毒性较强.结果 还表明dsRNA/Lipo-fectamine 2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性,dsRNA 0.08 μmol/L/ Lipofectamine 2000 8 μl/6孔培养板转染细胞48 h的抑制效应最强.结论 ①体外化学合成的 dsRNA 可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基因沉默效应.②三种不同的阳离子脂质体中 Lipofectamine 2000 的转染效率最强,且细胞毒性轻微.③dsRNA/Lipofectamine 2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性.

关键词：RNA干扰、双链RNA、绿色荧光蛋白

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分类号：R3(基础医学)

在线出版日期：2007-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：4-8