应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

摘要：

目的 利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系.方法 通过单向导RNA (sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的.首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建pCMV-hCas9-U6-Rev-erbβ sgRNA1&sgRNA2串联载体.然后将pCMV-hCas9-U6-Rev-erbβ sgRNA1&sgRNA2和pAd-E1/hRev-erbβ donor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系.最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβ HEK293细胞系(C3-6)进行检测.结果 敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβ mRNA和蛋白质的表达.结论 利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具.

关键词：CRISPR/Cas9、HEK 293细胞、Rev-erbβ、基因敲入、基因敲除

所属期刊栏目：32

分类号：R392-33;Q344+.14;Q78

资助基金：国家自然科学基金31470058;陕西省科技厅资助项目2012K19-02-03;中央高校基金项目GK201504009

在线出版日期：2017-03-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1446-1452