人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

摘要：

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础.方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4.构建好的质粒在E.coli BL21( DF3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度.将pcDNA3.1-myc/his(-) B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体.并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定.结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95％以上.ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白.结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体.

关键词：CTRP4、原核表达、基因免疫、多克隆抗体

所属期刊栏目：28

分类号：R392.11

资助基金：国家自然科学基金91129707;30971483

在线出版日期：2012-08-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：614-617,622