PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

摘要：

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了 PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法.首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响.利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定.菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功.PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6 μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6.经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白.SDS-PAGE 电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致.作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法.

关键词：大肠杆菌表达系统;EGFRvⅢ;表达条件优化;亲和层析;蛋白质印迹法

所属期刊栏目：40

分类号：Q511(蛋白质)

资助基金：国家自然科学基金项目;贵阳医学院院基金项目;贵州省教育厅大学生创新创业项目;黔科中引地项目;黔科合平台人才项目

在线出版日期：2021-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：42-49