NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的制备与鉴定

摘要：

[背景]猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病,近年来,NADC30-like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株.[目的]研制针对NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗.[方法]将PRRSVNADC30-like毒株编码GP5蛋白开放阅读框5(open reading frame 5,ORF5)、ORF6(编码M蛋白)分别连接至pFastBacTMDual载体P10和PH启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6,酶切鉴定后,将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 PH启动子下游,构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6.将上述3种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒.再将获得的重组杆粒转染至SF9昆虫细胞,发现细胞病变后收获病毒液,继续盲传3代,在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒.用第3代病毒液感染SF9细胞后,分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗,通过免疫电镜、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IF A)、Western blotting鉴定重组蛋白.[结果]成功构建了 3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6,酶切鉴定正确.通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒,分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6 和 Bacmind-30-ORF5-ORF6.重组杆粒感染 SF9 细胞 120 h时出现明显的细胞病变,收获病毒液后,在透射电子显微镜可观察到大小为50 nm左右呈现球形结构的VLPs.免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围;IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶;Western blotting结果表明,3种VLPs均出现特异性条带,并与预期大小一致.[结论]制备了 3种NADC30-1ike谱系PRRSV的病毒样颗粒,为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础.

关键词：NADC30-like猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、病毒样颗粒、重组杆状病毒

所属期刊栏目：49

分类号：S858.28;Q78;R392-33

资助基金：国家重点研发计划;国家重点研发计划

在线出版日期：2023-02-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：5287-5297