10.13344/j.microbiol.china.220579
四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用
[背景]猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原,并且常发生混合感染.[目的]建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法,对于临床诊断具有重要意义.[方法]针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的重组质粒标准品.通过对PCR反应条件优化,建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法.随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证.[结果]敏感性试验结果显示,对PEDV-M.TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×102、1.5×103、1.6×102和1.6×102 copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检出本研究中的4种靶病毒,而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出.重复性试验结果显示,选取108、106和104 copies/μL 3个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均扩增出清晰、均匀的条带.对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测,发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37％(19份)、6％(3份)、10％(5份)和25％(13份).其中PEDV和PoRV混合感染2份(4％),PEDV和TGEV混合感染2份(4％),PEDV和PDCoV混合感染1份(2％).通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100％.最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段.[结论]本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法,研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段.
多重RT-PCR、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒、猪轮状病毒
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R373.2;S858.28;R512.5
山东省自然科学基金青年项目;山东省重大科技创新工程;山东省现代农业产业技术体系;山东省农业重大应用技术创新项目;高层次人才工程项目
2023-02-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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