10.13344/j.microbiol.china.220686
PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用
[背景]猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒 A 型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展.猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失.[目的]建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法.[方法]参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoVN基因、SVAL/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV 和 PMD-SVA 作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果.[结果]最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25 μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV.PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致.经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85％、30.49％和57.32％,与已报道的检测方法一致.最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96％以上.表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性.[结论]建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑.
猪丁型冠状病毒、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒、塞内卡病毒A型、三重RT-PCR
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S858.28;TU472.22;Q78
国家重点研发计划2021YFF0703100
2023-02-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共12页
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