p21Ha-ras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

摘要：

目的:构建PET-28a(+)-Ha-ras原核表达质粒,并表达、纯化得到p21ras蛋白,为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础.方法:培养人肝癌细胞株7703,提取总RNA,通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA,然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras,重组质粒PMD-18T vector-Ha-ras经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA,将PET-28a(+)同样经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段,将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a(+)定向连接,构建出重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras,经酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实.将鉴定正确的PET-28a(+)-Ha-ras转入感受态BL-21(DE3)中诱导表达,利用组氨酸"标签"(His-Tag)对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化.结果:测序分析证实,克隆入PET-28a(+)的Ha-ras序列与Genbank登录号为"NM_005343"的Ha-ras cDNA序列一致,将重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras转化BL21(DE3).用IPTG诱导目的蛋白表达.SDS-PAG和蛋白纯化结果表明,PET-28a(+)-Ha-Ras在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白.结论:成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-Ha-ras,并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白,从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础.

关键词：原癌基因蛋白质p21(ras)、TA克隆、原核表达、亲合纯化

所属期刊栏目：23

分类号：R3(基础医学)

资助基金：云南省社会发展与科技攻关项目2006SG11

在线出版日期：2008-04-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：3655-3658