基于精氨酸酶切的蛋白质C端肽段富集方法的优化及评估
基于聚合物的蛋白质C端反向富集策略是用于研究蛋白质C端最为广泛的策略之一.目前,基于胰蛋白酶(trypsin)切割精氨酸残基C端(ArgC型酶切)的蛋白C端组学方法对蛋白质C端的鉴定深度仍有待提高.为解决这一问题,该研究对此方法进行了优化和评估:建立了基于"V型"过滤装置的"一锅法"富集流程,避免了副反应的干扰,缩短了样本的制备时间;优化了蛋白水平乙酰化反应条件,最大限度地降低了丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的副反应,提高了肽段鉴定的可信性;优化了基于固相萃取枪头膜片过滤柱(StageTip柱)的样品分离过程,使C端肽段的鉴定深度增加至原来的4倍.通过以上优化,按照肽段水平错误发现率(FDR) ＜0.01、离子分数(ion score)≥20,且C端带有乙醇胺修饰的数据筛选标准,从人HEK 293T细胞中共鉴定出696个蛋白质C端.若仅要求肽段水平FDR＜0.01,鉴定数目进一步增加到933个,这是基于聚合物富集策略的蛋白质C端组学方法所得的最大数据集之一.探索了胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)切割精氨酸残基N端(ArgN型酶切)与不同肽段N端衍生化修饰组合对蛋白质C端鉴定数目和种类的影响,"LysargiNase酶切+肽段N端乙酰化"新策略在原有"胰蛋白酶酶切+肽段N端二甲基化"策略的基础上将鉴定蛋白质C端的种类提升了47％.综上,该研究通过对基于Arg型酶切的蛋白C端组学方法的优化,提升了C端肽段的鉴定深度,扩大了C端肽段鉴定的覆盖范围.该方法将有望成为系统性表征蛋白质C端的有力工具.
化学乙酰化;蛋白质C端组学;反向富集;固相萃取枪头膜片过滤柱;生物质谱
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O658(分析化学)
国家自然科学基金;国家科技重大专项;中国科学院青年创新促进会项目
2022-03-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共11页
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