大鼠β-防御素2真核表达载体构建及转染大鼠角膜上皮细胞的研究

摘要：

目的：应用基因工程技术构建含大鼠β-防御素2( rat beta defensin 2,rBD-2)目的基因的真核重组质粒,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,检测目的基因在转染细胞中的表达,探讨应用该载体获得重组rBD-2在眼表细胞中表达的可行性,并为进一步研究rBD-2的体内外抗微生物活性提供实验基础,以期为感染性角膜病防治提供新方法。<br>　　方法：将采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成rBD-2 DNA 片段连接到真核表达载体 pIRES2-ZsGreen1的XhoⅠ与BamHⅠ酶切位点之间,构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞,卡那霉素筛选出阳性克隆子,经酶切、测序鉴定重组载体构建成功后,采用脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,此处实验分为三组即重组载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染的大鼠角膜上皮细胞组、未转染的空细胞组以及空载体pIRES2-ZsGreen1所转染的大鼠角膜上皮细胞组,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,最后经实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测各组转染细胞中rBD-2基因mRNA的表达差异。<br>　　结果：成功构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组质粒,应用实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测到重组质粒pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染组的大鼠角膜上皮细胞中rBD-2基因的mRNA表达水平明显多于另两组。<br>　　结论：应用基因工程技术构建的 rBD-2真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,能够使外源rBD-2基因在大鼠角膜上皮细胞中被转录成mRNA。

关键词：大鼠β-防御素2、真核表达载体、重组质粒、大鼠角膜上皮细胞

所属期刊栏目：17

分类号：R39;R78

资助基金：湖北省卫生和计划生育科研项目No. WJ2015MB194@@@@Health and family planning research project of Hubei province WJ2015MB194

在线出版日期：2017-03-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：422-426