随机扩增多态性技术联合荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法的建立

摘要：

目的 结合随机扩增多态性技术(RAPD)和荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR)的优势,建立快速、准确地检测结核分枝杆菌的新方法.方法 根据国内外文献设计随机引物,以结核分枝杆菌标准菌株 H37Rv 为模板进行 RAPD,产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取条带进行割胶纯化测序,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序上进行同源性检索,结果和结核分枝杆菌匹配率都达到99％.设计特异性内引物和探针,以RAPD产物为模板进行qPCR,并优化反应条件.分别以10倍梯度稀释的一系列浓度的H37Rv和其他阴性对照菌为模板,进行qPCR和RAPD-qPCR,分析其灵敏性和特异性.结果 qPCR能够检测到30 pg/μl的结核分枝杆菌,而RAPD-qPCR灵敏性提高到3 fg/μl.而且RAPD-qPCR检测30 pg/μl至30 fg/μl的结核分枝杆菌核酸时,扩增得到的Ct值都较小[(6.58±0.19))～(14.95±0.36)],结果稳定,易于判断.qPCR和RAPD-qPCR检测其他临床常见的细菌均呈现阴性.结论 RAPD-qPCR是一种快速、准确地检测出结核分枝杆菌的新方法.

关键词：结核分枝杆菌、随机扩增多态性技术、荧光定量聚合酶链式反应

所属期刊栏目：42

分类号：R378(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：2011年江苏省医学创新团队基金项目LJ201121

在线出版日期：2016-07-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1209-1213