利用CRISPR/Cas9技术构建能克隆难度序列的Stb12TM菌株

摘要：

Stb12TM菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功.利用CRISPR/Cas9技术将Stb12TM菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率.针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stb12TM菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证.结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stb12TM菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列.该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法.

关键词：CRISPR/Cas9技术、Stb12TM菌株、fhuA基因、pcnB基因

所属期刊栏目：43

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金;江苏省产学研合作项目;江苏省高校青蓝工程项目

在线出版日期：2023-01-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：87-93,100