中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立

摘要：

目的 建立中国流行的C基因型HBV的稳定复制表达细胞系.方法 从1例慢性乙肝患者血清中分离克隆得到1株C基因型病毒DNA全序列,以此为模板扩增产生1.3倍体HBV DNA,包含完整基因组(3.2kb)、从1825位点(polyA)至2599位点大小为775bp的3′端冗余序列,以及至1400位点大小为425bp的5′端冗余序列,将其连接改建重组后的pcDNA3.1(+)载体,构建pN31-51-6-1表达质粒,转染肝癌细胞系HepG2.采用ELISA检测HBsAg、HBeAg的瞬时表达情况,选择双高表达细胞孔进一步行G418筛选稳定表达细胞系.通过ELISA、免疫组化、直接免疫荧光流式细胞术以及HBV复制中间体核心颗粒DNA、细胞内cccDNA、分泌上清中病毒DNA的RT-PCR检测等方法评估稳定细胞克隆的复制表达情况.结果 获得1株具有高抗原表达和高复制能力的细胞克隆HepG2-51-6-1,已稳定传代26代.检测HBsAg、HBeAg吸光度(A)值分别为>3.5和1.29;直接免疫荧光流式细胞术证实细胞表面存在s抗原,免疫组化染色可见细胞内病毒表达.分泌到培养上清中的HBV DNA和细胞内的HBV复制中间体水平分别为2.0×104和5.5×105拷贝/ml,HBV cccDNA为6～8拷贝/细胞.结论 成功获得HBV-1.3倍体转染的C基因型HBV稳定复制表达细胞系,为研究我国流行HBV的生物特性和抗HBV新药筛选奠定了基础.

关键词：肝炎病毒、乙型、基因型、病毒复制、细胞系、抗原

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分类号：R512.62(传染病)

资助基金：国家"十一五"传染病重大专项子课题2008ZX10002-011;北京市自然科学基金重点课题7091006

在线出版日期：2011-01-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1425-1428