虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

摘要：

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法.优化后的反应组分:20.0μL TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、0.4μmol/L探针、1.0μL模板和5.2μL RNA-free H2O;优化后的反应程序:54.5℃15 min,95℃1 min;45个热循环扩增(95℃10 s,60.3℃30 s).本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×1010～1.4×101 copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×101拷贝的pMD18-MDNV标准质粒.分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27％和1.83％,具有良好的重复性和稳定性.利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5％(16/68).本研究建立的MDNV TaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持.

关键词：养殖对虾;行动障碍野田村病毒(MDNV);TaqMan RT-PCR;定量;检测方法

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分类号：S917(水产基础科学)

资助基金：国家重点研发计划项目;中国水产科学研究院基本科研业务费;中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费项目

在线出版日期：2021-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：77-85