人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

摘要：

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行PCR扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-Cl质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析；转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-Cl组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化:实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLDl及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的CDK4蛋白；SMMC-7721细胞中突变型的CDK4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变；与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08 vs 0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P＜0.05)；实验组CDK4 mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11 vs 1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P＜0.01),POLD1 mRNA相应地升高(2.47±0.25 vs 1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P＜0.01)；稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03 vs 0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P＜0.05),P125(0.54±0.04 vs 0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P＜0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.

关键词：肝细胞癌、突变、CDK4、POLD1

所属期刊栏目：20

分类号：R318.14(医用一般科学)

资助基金：国家自然科学基金;广西医科大学实验中心开放课题基金资助项目;广西医科大学研究生创新课题

在线出版日期：2012-10-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1705-1712