利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

摘要：

[目的]将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系.[方法]分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测.[结果]建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功.3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功.构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85％.[结论]利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础.

关键词：猪、Tet-on系统、CRISPR/Cas9系统、Sohlh1、基因敲除

所属期刊栏目：42

分类号：S828(家畜)

资助基金：国家重点研发计划;广东省现代农业产业技术体系

在线出版日期：2021-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1-8