双荧光素酶报告技术验证piRNA-DQ566704对smad2基因的靶向调控

摘要：

目的 通过双荧光素酶报告技术验证 piRNA-DQ566704 对 smad2 基因的靶向调控作用.方法 从小鼠肝星状细胞基因组中获取 smad2 基因的 3'UTR序列,分别合成包括 piRNA-DQ566704 结合位点在内的 smad2基因的 3'UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)基因片段,构建野生型(pGL6-miR-smad2-3'UTR-WT+pRL-TK)和突变型(pGL6-miR-smad2-3'UTR-MUT+pRL-TK)smad2 双荧光素酶报告基因载体.将 smad2 野生型与突变型双荧光素酶报告基因载体分别与 piRNA-DQ566704 mimic、piRNA-DQ566704 inhibitor和阴性对照(NC)等各组共转染 293T细胞,检测各组相对荧光素酶活性,观察 piRNA-DQ566704 对 smad2 基因表达的影响.通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和 Western blot验证小鼠肝星状细胞转染 piRNA-DQ566704 mimic、inhibitor、mimic NC后,小鼠肝星状细胞中 smad2 mRNA和 smad2 蛋白的表达.结果 携带 piRNA-DQ566704 mimic 和 smad2-3'UTR-WT 的构建体的相对荧光素酶活性明显下降(P<0.001),而对 smad2-3'UTR-MUT的构建体的相对荧光素酶活性无抑制作用(P>0.05).在小鼠肝星状细胞中过表达 piRNA-DQ566704 后,mimic组 smad2 mRNA和 smad2 蛋白的表达明显降低(P<0.001).结论 piRNA-DQ566704 可以靶向调控 smad2 基因的表达,smad2 是 piRNA-DQ566704 的直接靶基因.

关键词：荧光素、转染、piRNA-DQ566704、smad2

所属期刊栏目：44

分类号：R981.9

资助基金：西南医科大学-泸州市中医医院基地项目2019-LH011

在线出版日期：2023-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：748-753