基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

摘要：

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料.针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子.测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显.挑选T1不含荧光的种子进行培育得到的T2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化.本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考.

关键词：CRISPR/Cas9、ALB3基因、拟南芥、基因编辑、载体

所属期刊栏目：35

分类号：Q782;Q786;Q789(基因工程（遗传工程）)

资助基金：广东省攀登计划项目;国家自然科学基金项目;广东省自然科学基金项目;广东科技计划项目;大学生创新项目;培育计划项目;自治区研究生科研创新项目;广东省高校基础与应用基础研究重大项目

在线出版日期：2020-03-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：44-50