时空调控 miR-195敲减转基因载体的构建及验证

摘要：

目的：构建时空调控 miR-195敲减转基因载体并验证其活性。方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定，利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞，经荧光显微镜观察其荧光表达，利用实时定量 PCR 技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及 GFP 蛋白表达。结果通过将 Tet-on 四环素诱导系统中反义转录激活子 rt-TA 克隆到 NSE 启动子下游，以及 TRE-Tight 的多克隆位点内引入 miR-195海绵携带 IRES 介导的 EGFP ，获得双质粒 Tet-on 表达载体。以 pcDNA 3.1＋质粒为骨架，3个不同区域的双拷贝 cHs 4绝缘子核心片段为间隔，将其调控元件（ NSE-rtTA ）和反应元件（ TRE-miR-195 sponge-IRES-EGFP ）串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确，瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞，经强力霉素诱导36 h 后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达，且 miR-195表达水平明显降低。结论成功构建神经系统特异性 miR-195敲减转基因载体，并具有时空调控的特点，为进一步建立转基因动物模型奠定基础。

关键词：miR-1 9 5、转基因载体、Tet-on 四环素诱导表达系统

所属期刊栏目：39

分类号：R73;R32

资助基金：黑龙江省教育厅科学技术研究项目面上项目12531252Fund program Education Department of Heilongjiang Province 12531252

在线出版日期：2016-07-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：123-132