过表达死亡蛋白相关激酶2对TGF-β 1诱导的人肺成纤维细胞自噬和胶原蛋白分泌的影响

摘要：

目的:结合生物信息学分析结果研究死亡蛋白相关激酶2(DAPK2)在肺纤维化中的作用及分子机制。方法:从GEO数据库下载特发性肺纤维化(IPF)数据集GSE150910进行自噬相关基因的差异表达分析，利用极端梯度提升法筛选出关键基因。用t分布随机邻域嵌入法在单细胞测序数据集GSE135893中验证关键基因在细胞中的表达，采用Kaplan-Meier法在GSE28221和GSE93606数据集中绘制DAPK2高、低表达组患者的生存曲线。将12只6~8周龄的C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组，每组6只，实验组小鼠气管内滴注博来霉素构建肺纤维化模型，取小鼠肺组织进行Masson染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测DAPK2的蛋白和mRNA表达水平。将人肺成纤维细胞分为空载体慢病毒组、转化生长因子β
1(TGF-β
1)组、空载体慢病毒+TGF-β
1组、过表达DAPK2慢病毒+TGF-β
1组，应用蛋白质印迹法检测各组自噬相关蛋白以及Ⅰ型胶原蛋白(Collage Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collage Ⅲ)的表达，并应用MDC染色检测各组细胞的自噬小体所占比例。
结果:GSE150910数据集中筛选出32个差异表达的衰老相关基因，其中8个上调，24个下调。极端梯度提升法筛选出关键自噬相关基因DAPK2。单细胞测序分析提示DAPK2主要表达于肺成纤维细胞中，且在IPF患者肺组织内成纤维细胞的表达量低于正常肺组织(
P<0.05)；高表达DAPK2的IPF患者总体生存时间较低表达DAPK2的IPF患者更长(
P<0.05)。Masson染色提示小鼠肺纤维化模型造模成功，RT-qPCR及免疫组织化学染色结果提示DAPK2在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中为低表达(
P值均<0.05)。与TGF-β
1组和空载体慢病毒+TGF-β
1组比较，过表达DAPK2慢病毒+TGF-β
1组细胞中的LC3Ⅱ和Beclin 1蛋白表达水平升高，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Collage Ⅰ、Collage Ⅲ降低(
P值均<0.05)；自噬相关蛋白及Collage Ⅰ、Collage Ⅲ在TGF-β
1组和空载体慢病毒+TGF-β
1组间差异均无统计学意义(
P值均>0.05)。MDC染色结果提示过表达DAPK慢病毒+TGF-β
1组细胞内绿色点状荧光亮度明显增强，荧光斑点的数目也增多。
结论:DAPK2在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织内呈低表达，过表达DAPK2可以促进细胞自噬减轻TGF-β
1诱导的肺成纤维细胞分泌胶原蛋白，从而抑制肺纤维化的进展。

关键词：肺纤维化、自噬、死亡蛋白相关激酶2、生物信息学分析

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资助基金：四川省医学科研课题计划基金项目S21054;Sichuan Medical Research Project FoundationS21054

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：1720-1731