基于核酶开关的哺乳细胞内硫胺素焦磷酸荧光生物传感器的建立

摘要：

硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP)是维生素B1在细胞内的主要活性形式,也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代谢中重要的辅助因子.在细胞内,利用TPP适配体与天然核酶组装成的人工核酶开关调节靶基因表达,目前仅局限于原核、真菌或植物细胞.本实验将原核生物中筛选的“Switch-on”与“Switch-off"的两种类型的TPP核酶开关,运用重叠延伸PCR的方法构建于增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的3'非翻译区(UTR),转染人胚肾上皮细胞(HEK293),通过荧光显微镜和流式细胞仪分析,观察了不同浓度TPP对EGFP表达能力的调控.结果表明,构建的两种“Switch-on”和一种“Switch-off”核酶开关均表现出明显的TPP浓度依赖性,且具有良好的特异性,在150 μmol/L TPP时分别将EGFP的荧光强度提高3.1倍、1.9倍和降低2.3倍.这种构建通过TPP与核酶开关中其适配体的特异性作用直接将TPP浓度的变化转化为报告基因表达的改变,利于通过荧光检测方法实现对哺乳活细胞内代谢物或因子的无标记、无损伤、可视、高效的检测.

关键词：硫胺素焦磷酸核酶开关、增强绿色荧光蛋白、基因表达调控、荧光生物传感器、哺乳细胞

所属期刊栏目：45

分类号：R73;R72

资助基金：国家自然基金资助项目.21628502,21507156,31300096;江苏省青年基金资助项目Nos.BK20130357,BK20130351资助 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China.21628502,21507156,31300096;the Natural Science Foundation of Jiangsu ProvinceBK20130357,BK20130351

在线出版日期：2017-05-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：157-162