应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠

摘要：

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.

关键词：CRISPR/Cas9、基因编辑、miR-301a、基因敲除小鼠

所属期刊栏目：36

分类号：R-332(医学研究方法)

资助基金：国家自然科学基金81273958,81303102,81473478,81303103,上海市科委科技发展基金实验动物专项基金13140902500,14140901402,上海市优秀学科带头人计划XBR2011061,上海市教委创新项目12ZZ118,13YZ045,上海市教育发展基金会晨光计划13CG47,上海市卫生局科研基金20114Y001.Supported by National Natural Science Foundation of China No.81273958,81303102,81473478,81303103,Experimental Animal Special Fund of Science and Technology Commission of Shanghai No.13140902500,14140901402,Outstanding Subject Leaders Plan of Shanghai No.XBR2011061,Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission No.12ZZ118,13YZ045,"Chen Guang" Project of Shanghai Municipal Education Commission and Shanghai Education Development Foundation No.13CG47,and Shanghai Municipal Health Bureau No.20114Y001.

在线出版日期：2015-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：256-260