FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测

摘要：

目的 构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法 从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达 、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论 成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.

关键词：FANCJ、突变体、蛋白纯化、活性检测

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分类号：Q814.1(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家自然科学基金资助项目81470296,31701198;江苏省自然科学基金项目BK20170386;江苏省"科教强卫工程"青年医学人才项目QNRC2016719,QNRC2016771;江苏省卫生计生委医学科研课题面上项目H2017074;江苏省六大人才高峰2016-WSN-123;江苏省教育厅大学生实践创新训练项目201712688007Y

在线出版日期：2019-01-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：4584-4587