HDAC2磷酸化区域突变体的构建及其对小鼠成纤维细胞增殖的影响

摘要：

目的 应用片段缺失突变技术鉴定HDAC2自身磷酸化对其Sumo-E3连接酶活性及蛋白质翻译的影响.方法 以前期获得的鼠源性HDAC2 Sumo-E3连接酶结构域基因片段为模板,设计片段缺失突变引物,经长片段重叠延伸PCR技术扩增获得片段缺失突变基因片段,后于Top10大肠杆菌中自然连接扩增获得pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3连接酶磷酸化结构域缺失突变的真核表达载体.然后将载体转染于L929成纤维细胞瞬时过表达突变基因,再经翻译反应性荧光素酶报告基因实验和Western-blot鉴定HDAC2自身磷酸化修饰对Sumo-E3连接酶介导的报告基因和靶蛋白质表达的影响.最后通过MTT实验检测HDAC2自身磷酸化修饰对其Sumo-E3连接酶介导的L929细胞增殖的影响.结果 成功构建获得磷酸化修饰完全缺失的HDAC2片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3(DEL 394-424AA).LUC报告基因检测结果显示,DEL 394-424AA片段缺失突变体促进LUC翻译是对照组的4.24倍,且能显著促进靶蛋白ODC和c-Myc的表达,以及L929小鼠成纤维细胞的增殖效应.结论 HDAC2自身磷酸化修饰对HDAC2 Sumo-E3连接酶活性及其调节的蛋白质翻译和细胞增殖作用起负性调节作用.

关键词：HDAC2、Sumo-E3连接酶、磷酸化修饰、突变体构建、成纤维细胞

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分类号：Q71;Q78(生物大分子的结构和功能)

资助基金：国家自然科学基金30970661;81372060;国家重点实验室自主研究课题基金SKLZZ200907

在线出版日期：2015-07-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：1729-1731