哺乳动物雷帕霉素靶蛋白重组 RN Ai慢病毒载体的构建

摘要：

目的：构建哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）重组RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法按照RNAi设计规则，针对mTOR基因设计4个干扰靶点和阴性对照序列（FAM ），先用人工合成寡核甘酸片段，通过PCR拼接的方法，即可获得小干扰RNA（siRNA）有效片段，采用Lipofectamine 2000转染试剂，对肺腺癌A549细胞进行转染，1 d后，通过高倍荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白在肺腺癌A549细胞中的表达情况。采用半定量RT-PCR方法，检测mTOR基因在1 d后mRNA水平的表达，采用Western blot检测2 d后蛋白表达水平，从而筛选出最高效的干扰靶序列，将其合成双链DNA ，通过pGCL-GFP载体，与pHelper 1．0和pHelper 2．0质粒共同组成载体系统，进一步转染293T细胞，最终包装后产生慢病毒，通过Western blot方法检测GFP蛋白表达水平来检测293T细胞中的病毒滴度，并进行活性鉴定。结果 mTOR基因的高效siRNA干扰靶点被成功筛选出；mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌 A549细胞后，不管是从 mRNA 水平，还是蛋白水平，该基因都明显沉默；该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建，同时收获病毒上清，并检测出病毒滴度为1×108 UT/mL。结论 mTOR siRNA感染体外培养的人肺腺癌A549细胞，能够导致mTOR基因明显沉默；该基因mTOR siRNA的慢病毒载体被成功构建。

关键词：肺肿瘤、雷帕霉素靶蛋白、RNA干扰、慢病毒

分类号：R-332(医学研究方法)

资助基金：河南省卫生厅科技创新型人才工程项目4088；河南省医学科技攻关项目200803048；2010郑州大学研究生科学研究项目10Y13203。

在线出版日期：2014-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：2762-2766