利用9R-GFP-PHD检测细胞膜上PIP2的动态变化

摘要：

目的：通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白，并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）和 IP3的结合能力以及细胞膜上 PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶 C-δ1的普列克同源域（PHD）、荧光蛋白 GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系 BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化，其中 GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后，通过同位素实验和液体闪烁计数器，分别检测和比较 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的 PIP2和 IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外，利用MDCK细胞检测和比较孵育的 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后，3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在 ATP刺激后分布的动态变化，从而间接反映细胞膜上 PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力，而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后，荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP 主要分布在细胞质中，而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示，ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解 PIP2，从而使 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20％左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与 PIP2和 IP3结合特性及 GFP 的荧光可视和定量分析特性，有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化，将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。

关键词：C型磷脂酶类、穿膜多肽、普列克同源域、磷脂酰肌醇4、5-二磷酸、肌醇1、4、5-三磷酸

分类号：R5 ;R96

资助基金：教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题---青年教师类20123601120001；江西省教育厅科研基金资助项目GJJ13162。

在线出版日期：2014-07-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：2308-2311