应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒

摘要：

目的：应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5（GDF-5）基因重组腺病毒载体，并在 HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中，基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CM V ，Hind Ⅲ酶切鉴定。重组质粒经 PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理，电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183，使其在细菌内发生同源重组，卡那霉素筛选，Hind Ⅲ酶切鉴定阳性克隆，扩增重组腺病毒质粒，并转染 HEK293细胞，包装成重组腺病毒Ad-GDF-5，分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1．7 kb ，基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CM V-GDF-5、pShuttle-CM V-GDF-5-AdEasy-1经 Hind Ⅲ酶切后均得到大小约为1．7 kb的片段，与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出5．6×109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5，为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。

关键词：腺病毒科、生长分化因子-5、基因治疗

分类号：R39;R37

资助基金：国家自然科学基金资助项目81201407、81171472、81071270、30872614；四川省杰出青年学科带头人资助计划09ZQ026-005；四川省科技支撑计划项目2010SZ0048；南充市应用技术研究与开发资金项目11A0115；川北医学院科研发展计划项目重点培育项目CBY11-A-ZP01。

在线出版日期：2014-05-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：1412-1415