大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

摘要：

目的 利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法 采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法 在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1.将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1.酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒.采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western blotting技术分析目的 蛋白表达情况.结果 目的 基因按正确的方向重组入克隆载体中,重组腺病毒表达载体在HEK293A细胞中包装成功,获得成熟的腺病毒颗粒,病毒滴度为1.6×108 pfu/L,在HEK293A细胞中高表达.结论 该实验采用GatewayTM技术构建了含有大鼠ZnT1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究该基因在脊髓神经细胞中的表达以及与BDNF/TrkB信号调节通路的关系奠定了基础.

关键词：锌转运体-1、重组腺病毒、Gateway

所属期刊栏目：41

分类号：R37;R39

资助基金：国家自然科学基金资助项目81171799

在线出版日期：2012-08-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：2055-2057,2061,封2