HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

摘要：

目的 筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库.并采用 Matchmaker LexA 酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白.最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系.结果 成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白--促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白 5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等.最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down 以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带.结论 从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白--ACTH-R.

关键词：α防御素、双杂交系统技术、受体、促肾上腺皮质激素、人α、防御素3、胎肾上腺cDNA文库

所属期刊栏目：40

分类号：R73;R39

在线出版日期：2011-12-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：3335-3339,后插1