miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

摘要：

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平.方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和A geⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体.利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞.感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平.结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致.与对照组(0.8387±0.1456)比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平(12.6400±0.7884)明显升高(t=14.72,P<0.01),约为对照组的15.07倍.结论:成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒 , miR-186慢病毒成功感染 HEK293T细胞 , miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高.

关键词：miR-186、慢病毒、HEK293T细胞、过表达慢病毒载体、绿色荧光蛋白

所属期刊栏目：45

分类号：R346(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金资助课题81571157

在线出版日期：2019-10-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：997-1002,封2